79
podem ser incluídos nas avaliações de enxaguatórios bucais, assim como Candida albicans, para reforçar
a atividade fungicida.
7.7.1 Preparação dos microrganismos-teste
A partir da cultura estoque preparada, os microrganismos-teste são repicados sobre a superfície de Ágar
TSA e incubados a 35± 2ºC por 24 horas. Este repique é denominado R1.
Apartir do crescimento obtido na R1, osmicrorganismos-teste novamente são novamente transferidos para
uma nova superfície de Ágar TSA e são incubados a 35± 2ºC por 24 horas. Este repique é denominado R2.
As culturas geradas noR2 sãoutilizadas para os testes, incluindoos controles de toxicidadedoneutralizante,
resistência às condições ambientais e eficácia da neutralização. A suspensão é preparada de forma a
conter 10
4
a 10
5
UFC/mL. Uma vez confirmado o neutralizante conforme descrito acima, um novo R2 é
preparado para o teste.
Para a determinação da atividade antimicrobiana, utiliza-se uma suspensão de cada microrganismo-teste
na concentração de 10
8-
a 10
9
UFC/mL, para o caso de bactérias, e de 10
6
a 10
8
para o caso de leveduras e
fungos filamentosos.
7.7.2 Toxicidade e Eficácia do Neutralizante
O controle da existência de qualquer atividade tóxica do neutralizante sobre o microrganismo-teste é
necessário para garantir que o neutralizante usado no ensaio não afeta a viabilidade dos microrganismos
sobreviventes do Time Kill. Da mesma forma, a eficácia do neutralizante deve ser observada. Nos testes
de Time Kill, é imprescindível que o antimicrobiano cesse a sua ação exatamente no tempo desejado.
Somente desta forma é possível mensurar a curva de morte, que é a essência do Time Kill.
7.7.2.1 Avaliação da toxicidade do Neutralizante
A toxicidade do neutralizante a ser utilizado no teste é avaliada através de uma verificação específica. O
inoculo de cada microrganismo é adicionado ao neutralizante nas mesmas condições usadas no teste
da amostra, substituindo-se a quantidade de amostra por água. Tradicionalmente, como os testes são
realizados em tubos contendo 10 mL de solução, a proporção utilizada é a seguinte:
• Num tubo de ensaio contendo 8 mL de caldo neutralizante e 1mL de água estéril, adiciona-se
1mL da suspensão de inoculo contendo 10
4
a 10
5
UFC/mL (população inicial equivalente a 10
3
a
10
4
UFC/mL);
